Если найти гены биосинтеза, то можно перенести всю цепочку реакций из одного живого организма в другой.

Группа российских ученых из ИБХ РАН совместно с красноярским ИБФ СО РАН исследовала природу люминесцентного свечения сибирского червя Fridericia heliota и в прошлом году установила, что причиной свечения является необычный пептид — люциферин. В новой статье, вышедшей в Chemistry – A European Journal, описываются аналоги люциферина, которые удалось найти в тех же светящихся червях и обсуждаются пути биосинтеза нового люциферина. Один из авторов — Максим Дубинный, научный сотрудник лаборатории биомолекулярной ЯМР-спектроскопии Института биоорганической химии РАН.



Известно, что люциферины имеются у бактерий, светлячков, мелких морских ракообразных, глубоководных рыб, новый люциферин был открыт у червя Fridericiaheliota. Чем отличаются аналоги люциферина у различных животных, и какое это имеет значение? Какова физическая природа свечения живых существ?

Если кратко, то разные светящиеся живые существа светятся по-разному, биолюминесценция много раз возникала на разных ветвях эволюции жизни и каждый раз это было что-то новое, какой-то другой механизм. Всего разных механизмов около 30, до недавнего времени было известно только 7 люциферинов, мы открыли восьмой. Но собственно работа в Chemistry — A European Journal уже не про люциферин, а про его аналоги, которые, кстати, совсем не светятся.

А зачем же их тогда изучать? Чем они интересны?

Тут надо сформулировать, какую задачу мы глобально решаем, в какую сторону двигаемся. Данная работа — один небольшой шаг к биосинтезу люциферина. Биосинтез вещества «икс» — это последовательность биохимических реакций в живом организме, ведущих к появлению «икс». Реакции начинаются с тех молекул, которые организм берет из окружающей среды: с пищей, от симбионтов и заканчиваются получением вещества «икс».

Биосинтез многих важных для живых организмов веществ (аминокислот, нуклеотидов, жирных кислот, витаминов) хорошо изучен и подробно описан в научной литературе, но каждое новое открытое природное соединение самим фактом своего существования ставит загадку своего биосинтеза. За каждый шаг биосинтеза, за каждую химическую реакцию отвечает свой фермент, который кодируется своим геном. «Длинная рука генов» делает всю работу. Если найти гены биосинтеза, то можно методами генной инженерии перенести всю цепочку реакций из одного живого организма в другой, и в нем тоже появится вещество «икс», например, люциферин Fridericia heliota в бактерии Escherichia coli.

И бактерии будут светиться?

Если добавить в бактерию ген люциферазы из тех же червей — то да, будут светиться. Но мы еще далеки от этого, нам неизвестен ни точный путь биосинтеза, ни ген люциферазы. Но найденные аналоги люциферина дают нам намеки, из чего и каким путем мог бы этот самый люциферин образоваться. Биосинтез проходит через много промежуточных стадий, на каждой стадии получается новое вещество, которое чем-то отличается от предыдущего, и если мы будем «выдергивать» из червей все вещества, которые напоминают люциферин, есть шанс, что мы найдем те из них, через которые проходил путь биосинтеза люциферина.

Собственно, в этом и заключается суть опубликованной работы — мы нашли в червях четыре аналога люциферина, плюс сам люциферин, плюс один аналог был найден два года назад до того, как мы нашли люциферин. Все они — необычные пептиды, содержащие один их двух сходных компонентов, CompX или CompY, так мы их назвали. Люциферин содержит CompX, а некоторые его аналоги — CompY. И теперь, если положить рядом все найденные химические формулы, то можно увидеть два возможных пути биосинтеза — начиная с CompX и начиная с CompY. Какой из них правильный — мы пока не знаем, хотя путь через CompX нам нравится больше, он проще и логичнее.

То есть вопрос биосинтеза остался открытым?

Да, чтобы его прояснить, нужно идти дальше — искать ферменты, аминокислотные лигазы, которые собирают аминокислоты вместе и изучать их активность. Если наша гипотеза о биосинтезе правильная, то такие ферменты мы найдем, и они соберут из аминокислот наш люциферин, по одному пути или по другому, но это отдельная большая работа, которую еще предстоит сделать. Пока главный результат — необычных пептидов много, черви синтезируют пептиды из аминокислот то так, то эдак, и один из полученных пептидов светится.

Анализ компонентов, хроматографически выделенных из экстракта червей Fridericia heliota, проводился методом ЯМР — спектроскопии. Как это происходит? В чем преимущества и недостатки этой методики?

Тут комбинация разных крутых методов, у нас коллаборация отличных специалистов, мы работаем в очень сильной команде. Если взять и просто сломать клетки, то получится каша, вся химия какая есть в червях в невообразимой смеси, пойди «найди иголку в стоге сена». Смесь можно разделить на хроматографе, получится много пиков, каждый пик — это еще смесь, ее можно делить дальше, на другом хроматографе или в других условиях и когда-нибудь дойти до индивидуальных химических соединений. Но будет ли это то соединение, которое нам нужно, или окажется чем-то тривиальным и совсем неинтересным? Вот тут уже начинается искусство, и наши красноярские коллеги Валентин Петушков и Наталья Родионова прекрасно справились с этой задачей.

Когда они искали люциферин, их путь освещал яркий свет биолюминесценции, и после проверки на люминометре было ясно, какую фракцию с хроматографа брать на дальнейшую очистку. Еще до того, как мы открыли люциферин, Валентин Петушков заметил, что вместе с люциферином появляются похожие соединения: у них близкий спектр поглощения в УФ/видимом диапазоне, а значит, они содержат тот же хромофор, тот же химический фрагмент. Благодаря этому наблюдению удалось выделить из червей сам хромофор — мы назвали его CompX — затем синтезировать его (здесь в игру вступает группа синтеза природных соединений под руководством Ильи Ямпольского) и наконец определить формулу люциферина (то, что мы сделали в прошлом году).

Похожие на люциферин соединения на этом не закончились, и Валентин Петушков с Натальей Родионовой продолжили мне их поставлять, а я — анализировать на ЯМР спектрометре. Оказалось, что там не один, а два разных хромофора (CompX и CompY), они очень похожи, и по химической формуле, и по спектрам поглощения. Группа Ильи синтезировала CompY, но в индивидуальном виде мы его в червях не нашли, только в составе необычных пептидов. Кроме анализа ЯМР спектров, каждая из формул была проверена на масс-спектрометре, в случае ошибки в моем определении масса молекулы и брутто-формула не сошлись бы, тем не менее для всех пептидов разные методы дают однозначный результат, значит, все формулы правильные.

Какую еще информацию можно получать с помощью ЯМР-спектроскопии?

Можно получить пространственную структуру белка, водорастворимого или мембранного, изучать его динамику, определять, каким образом белковая молекула взаимодействует с другим белком, с низкомолекулярным лигандом. ЯМР помогает проложить мостик между чисто расчетными методами (молекулярная динамика) и подвижностью реальной молекулы в эксперименте, это делается при помощи ЯМР-релаксации. Методом ЯМР можно изучать так называемые неупорядоченные белки, это белки, которые не имеют определенной пространственной структуры, но при этом выполняют свою функцию.

Для органической химии ЯМР — совершенно незаменимый метод. Проводит химик реакцию, а что в результате — получилось? Нет? Если нет, то что получилось? ЯМР в руках хорошего специалиста дает все ответы, это глаза и уши химика-синтетика.

Столкнулись ли вы с какими-либо трудностями во время эксперимента?

Один раз я уронил на кафельный пол пробирку, в которой было пять микрограмм люциферина — все, что Валентин с Наташей собрали за три года. Пробирка не разбилась, как бы развивался проект при другом исходе — я не знаю.

Наши ЯМР-спектрометры очень дорого стоят, содержание и обслуживание требует миллионов рублей каждый год, и это постоянная проблема. Мы можем работать с таким малым количеством вещества — от нескольких десятков микрограмм — благодаря криогенно-охлажденным датчикам. Выигрыш в чувствительности пятикратный, без криодатчиков никакого люциферина быть не могло бы в принципе, равно как и многих других проектов. Но это проблема финансирования науки и организационная проблема отношений лаборатории с администрацией института.

Как в дальнейшем Вы планируете развивать данное направление исследований?

Сделать светящиеся бактерии, цветочки, мышек, кошек, собачек, а потом и человека, мальчика и девочку и отправить их в созвездие Тау-Кита. А если серьезно, то конкретно этим проектом по биолюминесценции руководит сотрудник лаборатории синтеза природных соединения ИБХ РАН Илья Ямпольский, и в наших ближайших планах — исследование люциферина грибов, люциферазы червей и продукта окисления люциферина. Следите за нашими публикациями.

Источник: http://scientificrussia.ru/theory/deliteli-sutok